猪MSTN、pAPN和CD163基因同步编辑的胚胎制备

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摘要：CRISPR/Cas9作为一款强大的基因编辑工具，在猪的遗传改良中已经广泛应用。然而，单一基因的编辑无法满足多性状的同步改良。为利用CRISPR/Cas9基因编辑体系构建 和CD163多基因编辑猪胚胎成纤维细胞（porcine embryonic fibroblasts，PEF）并制备胚胎，首先，根据猪CD163、MSTN和pAPN蛋白功能结构域，选定MSTN外显子1、CD163外显子7及 pAPN 外显子2作为打靶区域，各设计2对sgRNAs，连接至骨架pX330载体，通过电转染至PEF，筛选每个基因编辑效率较高的 sgRNA ;然后，利用同源重组法将 CDI63，MSTN，pAPN 单个基因的sgRNA表达盒组装成一体化串联表达系统，转化至Fast-T1感受态细胞并进行Sanger测序鉴定；最后，利用电转染方式将3基因敲除载体转染至PEF，用 2.5μg⋅mL-1 的嘌呤霉素进行药筛，挑选单克隆细胞，PCR扩增后进行Sanger测序，鉴定单克隆细胞 MSTNN.CDI63、pAPN 基因的打靶序列。（剩余24218字）