p53V149F 突变打靶载体及细胞模型的构建

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摘要： 【目的】构建p53 基因突变模型，为研究p53 基因突变引发肿瘤的发生和进展提供细胞模型资源。【方法】利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术，根据 p53V149F 突变位点的序列，在线设计合成单链向导sgRNA，构建CRISPR 打靶载体；将重组载体转染细胞，流式分选阳性细胞群，提取细胞基因组，Sanger 测序分析Cas9 核酸酶对靶位点的切割情况，构建同源修复模板，通过T7EN1 试验进一步检测编辑效率；将重组载体和同源模板通过电转染方法共同转染至成纤维细胞中，通过单克隆挑取、PCR 和Sanger 测序鉴定挑取含目标突变的细胞株。（剩余11905字）